CWICZENIE 2 - 2016- 2017-20161014-174559629

SAVE OFFLINE

Projektowanie starterów do PCR. Metody znakowania i hybrydyzacji kwasów nukleinowych. Sekwencjonowanie DNA Wprowadzenie dr hab. Michał Rurek II r. biotechnologii, gr. 1 i 2 (Inżynieria genetyczna) rok akademicki 2016/ 2017 gr. 1- sala C, 12:30-14:30, 14.10.2016 gr. 2- sala Owalna, 15:00-17:00, 19.10.2016 Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Konwencja zapisu sekwencji kwasów nukleinowych ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAC

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Konwencja zapisu sekwencji kwasów nukleinowych ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAC TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTG

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Kierunek odczytu nici DNA nie jest symetryczny

GCTCGATCGACCATGGACGC mRNA mRNA GCTCGATCGACCATGGACGC ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAC TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTG Polimerazy, restryktazy, rybosomy i inne enzymy odczytują nić DNA/RNA tylko w jednym kierunku

Jak oznaczamy ten kierunek?

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Jak oznaczamy kierunek odczytu nici DNA/RNA? 5’P-ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT-OH3’ 3’OH-TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTA-P5’

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

5’

3’

3’

5’

5’P-ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT-OH3’ 3’OH-TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTA-P5’

POLIMERAZA

5’P-ACTGACTAGCTCGAT-OH3’ 3’OH-TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTA-P5’

5’P-ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT-OH3’ 3’OH-ATCGATCGTA-P5’ POLIMERAZA

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Co jest wymagane do PCR? Synteza DNA wymaga startera Starter

Polimeraza DNA Nowy DNA

Brak syntezy DNA

Synteza DNA

Starter wyznacza fragment DNA, który ma być skopiowany Starter

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim Figure 2.6 Genomes 3 (© Garland Science 2007) zabronione!

Termostabilne polimerazy DNA

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Lokalizacja starterów DO PCR na matrycy 5’ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT3’ 3’TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTA5’

5’ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT3’

3’TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTA5’ Gdzie powinny przyłączać się startery pamiętając o ich ukierunkowaniu 5’ 3’ Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Lokalizacja starterów DO PCR na matrycy 5’-ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT-3’ 5’TGATCGAGC3’ 5’TGCGATCGA3’ 3’ACTAGCTCG5’ 3’ACGCTAGCT5’ 3’-TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTA-5’

’

5’-ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT-3’ 3’TGATCGAGC5’ 3’TGCGATCGA5’

5’ACTAGCTCG3’ 5’ACGCTAGCT3’ 3’-TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTA-5’

’

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Lokalizacja starterów na matrycy 5’ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT3’ 3’TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTA5’

5’ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT3’ 3’GCGATCGAT5’ starter F

starter R

5’CTAGCTCGA3’ 3’TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTA5’

’

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Cykle PCR 5’ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT3’ 3’GCGATCGAT5’ R

F

5’CTAGCTCGA3’ 3’TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTA5’

’

Cykl 1

5’ACTGACTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT3’ 3’TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGAT5’ R

F

5’CTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT3’ 3’TGACTGATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGATCGTA5’

Cykl 2

’

5’CTAGCTCGATCGACCATGGACGCTAGCTAGCAT3’ 3’GATCGAGCTAGCTGGTACCTGCGATCGAT5’ R

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Znaczenie specyficzności i długości starterów

Dlaczego ok. 20n ?

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Temperatura wiązania starterów powinna być zbliżona do ich temperatury topnienia

Tm starterów zależy od ich długości oraz proporcji par C/G do A/T Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Temperatura topnienia obu starterów powinna być wyrównana Startery o wyrównanej Tm(55°C)

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Startery o różnych Tm (50°C/ 60°C)

W starterach należy unikać sekwencji tworzących: dimery spinki

Startery muszą być homologiczne do matrycy na 3’ końcu, lecz niekoniecznie na 5’ końcu Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Dimeryzacja starterów

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Programy do identyfikacji pozycji starterów http://primer3.ut.ee/

paste seq here (FASTA!!!!) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ257688.1 !!!!!!!!!

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Programy do identyfikacji pozycji starterów

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Przeszukiwanie specyficznych sond hybrydyzacyjnych

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/DQ257688.1

Primer-BLAST

Pick Primers

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Primer-BLAST

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Primer-BLAST

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Odwrotna transkrypcja- przygotowanie puli RNA CO POTRZEBUJEMY DO ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI? 1.Wyizolowany mRNA; 2. Woda wolna od nukleaz; 3. Bufor RT + Mg! 4. Mieszanina dNTPs; 5. Inhibitor RNAz; 6. Primer oligo(dT) 7. RT AMV reverse transcriptase- transkryptaza AMV Avian Myeloblastosis Virus- wirus białaczki mieloblastycznej ptaków 2 podjednostki: a (62 kDa) i b (94 kDa), aktywny dimer ab do syntezy krótkich cDNA („amator”) wpływ struktury drugorzędowej RNA na syntezę cDNA wykazuje również aktywność RNAzy optimum temperaturowe 42oC

M-MULV reverse transcriptase- transkryptaza M-MULV Maloney Murine Leukemia Virus- wirus białaczki ptaków (inny) Monomer, 71 kDa produkt genu pol retrowirusa wymaga Mg do syntezy długich cDNA („sprinter”) mała aktywność RNazy optimum temperaturowe 37oC Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim Figure 5.13 Genomes 3 (© Garland Science 2007) zabronione!

Synteza cDNA

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Klonowanie cDNA

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Amplifikacja ściśle określonych obszarów cDNA do precyzyjnego klonowania

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Łączenie sekwencji kodujących różne ORF nie może zmieniać ich ramki odczytu

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Projektowanie starterów do mutagenezy punktowej

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Projektowanie starterów do wprowadzenia miejsc restrykcyjnych

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Projektowanie starterów do mutagenezy delecyjnej

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Projektowanie starterów do mutagenezy insercyjnej

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

1. Detekcja znaczników. a. Znaczniki radioaktywne. Identyfikacja DNA znakowanego radioaktywnie opiera się na detekcji promieniowania b. Promieniowanie to można zlokalizować wykonując ekspozycję sygnału na błonie radiologicznej lub przy wykorzystaniu sprzętu do pomiaru promieniowani radioaktywnego, takiego jak licznik scyntylacyjny. Aparaty typu Phosphoimager łączą natomiast obie te funkcje, gdyż umożliwiają zarówno lokalizację sygnału na membranie (skanowanie) jak i pomiar jego intensywności. b. Znaczniki nieradioaktywne. Obecność znaczników nieradioaktywnych można zidentyfikować na podstawie ich aktywności własnej (bezpośrednie) lub aktywności enzymów połączonych ze znacznikiem (pośrednie).  bezpośrednie. Związki wbudowane do DNA, takie jak rodamina, kumaryna czy fluoresceina, charakteryzuje się zdolnością do emisji światła o określonej długości fali w świetle UV. Ich detekcja odbywa się przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego.  pośrednie. Czulsze metody detekcji znaczników nieradioaktywnych oparte są na technikach enzymatycznych. Znaczniki takie jak biotyna, digoxigenina oraz floresceina rozpoznawane są przez specyficzne przeciwciała (ew. streptavidynę w przypadku biotyny) sprzężone z enzymami takimi jak alkaliczna fosfataza, peroksydaza. Enzymy te po przyłączeniu się do znacznika katalizują reakcje, które prowadzą do luminescencji lub powstania barwnych produktów. 6. Wybrane właściwości izotopów radioaktywnych używanych w pracach eksperymentalnych biologii molekularnej. okres półrozpadu

energia rozpadu

32

14,3 dni

1,71 MeV

b

35

S

87 dni

0,167 MeV

b

3

H

12,3 lat

0,018 MeV

b

5730 lat

0,156 MeV

b

60 dni

0,035 MeV



izotop P

14

C

125

I

promieniowanie

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

a. Jednostki aktywności promieniowania. – jednostką promieniowania w układzie SI jest Bq (becquerele). 1 Bq = 1dps (1 rozpad na sekundę). Jednostki pochodne to GBq, MBq, kBq. – ponadto wciąż u użyciu są jednostki Ci (curie). 1Ci = 3,7 x 1010Bq (37GBq) (1Gbq = 0,027Ci). Jednostkami pochodnymi dla Ci są Ci, mCi. b. Aktywność specyficzna. Ilość rozpadów radioaktywnych na jednostkę masy lub objętości, np. Ci/g, mCi/mmol, dpm/g. c. Rodzaje promieniowania emitowane przez izotopy radioaktywne: a - jądra helu 42He, b - elektrony,  fotony (fale elektromagnetyczne).

Znakowanie radioaktywne fragmentów DNA: kinaza polinukleotydowa faga T4 (PNK), polimeraza I DNA Synteza w kierunku 5’-3’ Nowy DNA

kinazowanie

32P dATP matryca

polimeraza DNA

Aktywność egzonukleazy 3’-5’

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

nick translation

reakcja heksamerowa

a32P dATP/dCTP

nukleotyd nieprawidłowy

odwrócenie kierunku poruszania się polimerazy DNA

Aktywność egzonukleazy 5’-3’ usunięte nukleotydy

(random priming) Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Wydziałowa Pracownia Izotopowa- dozymetry i licznik scyntylacyjny

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Wydziałowa Pracownia Izotopowa- praca z 32P

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i Pracownia izotopowa 32Pudostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Zasada hybrydyzacji kwasów nukleinowych Typowe składniki

DNA

mieszaniny hybrydyzacyjnej SSC rejony niesparowane

formamid

80OC lub sieciowanie UV

DNA ze spermy łososia EDTA SDS Roztwór Denhardta

znakowana sonda

DNA wiąże się z filtrem hybrydyzacyjnym za pomocą szkieletu fosfocukrowcowego

(BSA/ PVP/ Ficoll) Woda

wiązanie niespecyficzne

wiązanie specyficzne

Tm- temperatura topnienia hybrydów

przemywanie

film RTG

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

znakowana sonda

filtr hybrydyzacyjny

Kuchenka hybrydyzacyjna oraz crosslinker Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Szukamy genu jak „igły w stogu siana”- przenoszenie DNA i test hybrydyzacyjny metodą Southerna Przeniesienie fragmentów DNA z żelu na filtr hybrydyzacyjny Marker DNA

DNA po hydrolizie restrykcyjnej

Ręczniki papierowe Filtr nylonowy

Bufor

Żel agarozowy

Żel

Bibuły

Filtr nylonowy

Stolik

Analiza hybrydyzacyjna

Piętna hybrydyzacyjne

Sonda DNA (przygotowana i wyznakowana wcześniej)

Autoradiografia

Filtr nylonowy

Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Interpretacja wyników analizy Southern

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Hybrydyzacje northern

y

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Phosphoimager- wizualizacja wyników

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Nieradioaktywne systemy detekcji- mechanizmy i przykłady

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Nicholl, Genetic engineering

Cel sekwencjonowania  dostarcza wielu cennych informacji o strukturze i funkcji genów  znajomość pełnej sekwencji DNA badanych organizmów umożliwia zrozumienie molekularnych mechanizmów ich funkcjonowania i ich ewolucji  umożliwia znalezienie i dalszą analizę mutacji

Historia rozwoju metod sekwencjonowania DNA  1977‐ Allan Maxam i Walter Gilbert ogłaszają publikację Sekwencjonowanie DNA przez chemiczną degradację; w tym samym czasie Frederick Sanger publikuje metodę sekwencjonowania DNA przez syntezę katalizowaną enzymatycznie  1980‐ Sanger i Gilbert otrzymali Nagrodę Nobla  1982‐ utworzono GenBank ‐ publiczne repozytorium sekwencji DNA Andre Marion i Samuel Eletr utworzyli firmę Applied Biosystems, która w tym okresie zdominowała automatyczne sekwencjonowanie DNA  1982‐ Akiyoshi Wada zbudował roboty sekwencyjne dla firmy Hitachi  1984‐ kompletna sekwencja genomu (170 tys. pz) wirusa Epsteina‐Barra  1997‐ zsekwencjonowano genom bakterii (5Mb)  15.02.2001‐ konsorcjum HUGO opublikowało sekwencję genomu ludzkiego w Nature  16.02.2001‐ firma Celera Genomics opublikowała sekwencję genomu ludzkiego w Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i Science udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Wybrane zsekwencjonowane genomy eukariotyczne Organizm

Rok

Miliony zsekwencjonowanych zasad Liczba genów kodujących białka

Saccharomyces cerevisiae Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Arabidopsis thaliana Człowiek: robocza/ pełna {KP} Człowiek: robocza {Celera} Takifugu rubripes Oikopleura dioica Mus musculus Anopheles gambiae Ciona intestinalis Rattus norvegicus Gallus gallus Oryza sativa Pan troglodytes

1996 1998 2000 2000 2001-4 2001 2001 2001 2002 2002 2002 2004 2004 2005 2005

12 97 116 115 2693/ 2900 2654 365 65 2600 Kopiowanie, 278 rozpowszechnianie w sieci i 153 2750 udostępnianie materiałów osobom trzecim 1000 389 zabronione! 2843

6000 19099 14000 25498 20000- 25000 39114 20000 15000 30000 14000 16000 30000 20000- 23000 37544 20000- 25000

Projekt Poznania Genomu Człowieka (1987) Departamentu Energii USA; od 1988 przejęty przez Narodowy Instytut Zdrowia; od 1989 Narodowy Instytut Badań Człowieka (NHGRI, Maryland, USA) Międzynarodowy Projekt Poznania Genomu Człowieka (NHGRI + The Sanger Centre, Cambridge, UK) od 1990 algorytm BLAST do badań sekwencji i sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) Celera Genomics Corporation + J. Craig Venter (od 1998)- sekwencjonowanie shotgun (dotychczas klon po klonie) koniec prac- wersja robocza genomu człowieka- 2001; wersja finalna- 2004

Metoda Maxama‐Gilberta  polega na użyciu związków chemicznych do specyficznej hydrolizy DNA  cztery niezależne reakcje, w których wykorzystuje się cztery różne odczynniki specyficzne dla poszczególnych zasad: 1. linia „G” – DMS, piperydyna 2. linia „G+C” ‐ kwas mrówkowy, piperydyna 3. linia „T+C” – hydrazyna, piperydyna Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i 4. linia „C” – hydrazyna+ NaCl, piperydyna udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Metoda Sangera  metoda terminacji wydłużania łańcucha (tzw. metoda dideoksy)  wykorzystuje polimerazę DNA, która ma zdolność do syntezy wiernej, komplementarnej kopii jednoniciowego DNA matrycowego oraz używa 2’3’-dideoksynukleotydów jako substratów  początkowo wykorzystywany był fragment Klenowa polimerazy DNA (brak aktywności egzonukleolitycznej 5’-3’, ale sekwencjonowania do 250 nt i tzw. „cienie”)  zastąpiono go naturalną lub zmodyfikowaną polimerazą DNA z faga T7 (sekwenaza)- szybka, procesywna, można używać różne terminatory, brak aktywności egzonukleolitycznych 5’-3’ oraz 3’-5’  zastosowanie polimerazy z Thermus aquaticus (Taq DNA polimeraza) pozwala na prowadzenie terminacji łańcucha w temperaturze 65‐70°C, co minimalizuje artefakty spowodowane strukturą II-rzędową  startery uniwersalne lub specyficzne do matrycy (PCR, wklonowany insert)

Klon zrekombinowany

insert

polilinker (MCS, multipurpose cloning site) wektor

W mieszaninie reakcyjnej powstaje zbiór częściowo zsyntetyzowanych cząsteczek, z których każda zawiera taki sam koniec 5’, ale różni się długością od strony końca 3’   Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

 

Żel sekwencyjny 6% 7M mocznik (zapobiega tworzeniu się struktur II-rz.) : wysoka rozdzielczość jednoniciowych fragmentów DNA (10-1500 nt) elektroforeza przebiega przy natężeniu prądu wystarczającym do podgrzania żelu do ok.70°C, co przeciwdziała powstawaniu struktur II-rz. autoradiografia nieizotopowe metody identyfikacji: chemiluminescencyjne, chromogeniczne, fluorogeniczne

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Nowe sekwenatory  rozdział w kapilarach, a nie w żelu poliakryloamidowym; 96 kanałów – 96 sekwencji (2 godziny); 1000 sekwencjowań w Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i ciągu doby udostępnianie materiałów osobom trzecim  sekwencjonowanie cykliczne (Sears i wsp., 1992) zabronione!  nowe cechy:ƒmateriałem wyjściowym jest dsDNA (np. produkty PCR), nie ma konieczności klonowania sekwencjonowanego fragmentu, mała ilość matrycyƒ

Sekwencjonowanie automatyczne (kapilarne) z wykorzystaniem dideoksyrybonukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (1987- Prober)

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Brown, Genomes

Chromas Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Pirosekwencjonowanie brak ddNTPs i innych terminatorów!

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Techniki wysokoprzepustowe - identyfikacja osobników podatnych na określone schorzenia (nowotwory, choroby neurodegeneracyjne); - genotypowanie prenatalne- nawet bezpośrednio z osocza matki (np. wykrywanie zespołu hemolitycznego u płodu; czynnik RhD); - maksymalizacja efektywności leczenia, minimalizacja występowania skutków ubocznych; - metody wysokoprzepustowe (high-throughput): analizy mikromacierzowe (microarrays) lub sekwencjonowanie nowej generacji (next generation sequencing, NGS); - techniki NGS nie opierają się na rozdziałach żelowych i m.in. dzięki temu są łatwe w automatyzacji

składanie kontiga Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione! Illumina

Metody sekwencjonowania genomów- wprowadzenie „Klon po klonie”

„Shotgun”

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!

Zadanie domowe 1. Sekwencje cDNA do analizy: E1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_100991.2 E2 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_105500.2 E3 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001084951.2 E4 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_148368.2 E5 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_148368.2 C1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_201920.3 C2 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_201920.3 2. Przenieść do Worda sekwencje w formacie FASTA. 3. Zaznaczyć w sekwencji obszar ORF. 4. Znaleźć startery zakotwiczone w 5’UTR (starter F) 3’UTR (starter R). http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ 5. Przynieść wydruk z zaznaczoną sekwencją ORF i pozycjami obu starterów.

Kopiowanie, rozpowszechnianie w sieci i udostępnianie materiałów osobom trzecim zabronione!