13. Izotachoforeza

SAVE OFFLINE

IZOTACHOFOREZA KAPILARNA (CITP – capillary isotachophoresis)

dr inż. Tomasz Dymerski Politechnika Gdańska, Wydział Chemiczny

DEFINICJA IZOTACHOFOREZA (capillary isotachophoresis – cITP lub ITP) – analityczna technika elektromigracyjna rozdzielania jonów (kationów lub anionów), które w polu elektrycznym przy zastosowaniu odpowiedniego elektrolitu wiodącego i terminującego (kończącego) formują się w strefy według ich zmniejszającej się ruchliwości i poruszają z jednakową prędkością.

Ruch analizowanych jonów wywołany jest przyłożonym zewnętrznym polem elektrycznym, a ich szybkość poruszania jest wprost proporcjonalna do natężenia tego pola.

ETYMOLOGIA Słowo izotachoforeza pochodzi z języka greckiego: iso = równy, tachos = szybkość, phoresis = migracja

ELEKTROFOREZA KAPILARNA STREFOWA ELEKTROFOREZA KAPILARNA (capillary zone electrophoresis – CZE) – technika rozdzielnia jonów, które w polu elektrycznym przy zastosowaniu odpowiedniego elektrolitu podstawowego (background electrolyte – BGE), wypełniającego cały układ analityczny, formują się w strefy według ich zmniejszającej się ruchliwości i poruszają z różną prędkością.

Podstawą rozdzielania jonów jest różnica w ruchliwości elektroforetycznej (CZE i ITP) !!!

UKŁAD POMIAROWY

WARUNEK KONIECZNY ITP Podczas jednorazowej analizy techniką izotachoforezy mogą być rozdzielane tylko jony o tym samym znaku, a elektrolity dobiera się w taki sposób, aby kation albo anion elektrolitu wiodącego (LE – leading electrolyte) i terminującego (TE – terminating electrolyte) miał odpowiednio najwyższą i najniższą ruchliwość jonów (µ) w stosunku do jonów próbki (analitów). Zatem warunkiem rozdzielania techniką ITP jest:

µLE > µANALITY > µTE

SUBSTANCJE OZNACZANE Techniką ITP można oznaczać substancje, których cząsteczki poruszają się w polu elektrycznym, czyli są obdarzone ładunkiem elektrycznym dodatnim (kationy) bądź ujemnym (aniony). Cząsteczki obojętne w polu elektrycznym nie porusza się.

MODEL ROZDZIELANIA JONÓW a) Wprowadzenie próbki między granicę dwóch elektrolitów: wiodącego (L) i terminującego (T). b) i c) Rozdzielanie jonów próbki w kolejnych przedziałach czasowych. d) Ustalenie się stan równowagi stężeń jonów w poszczególnych strefach – każdą strefę wewnątrz kapilary tworzy jeden rodzaj jonów. Strefy po osiągnięciu równowagi poruszają się ze stałą szybkością równą szybkości poruszania się strefy wiodącej i stąd nazwa izotachoforeza, czyli elektroforeza przy stałym poruszaniu się stref.

PODSTAWY TEORETYCZNE Wszystkie strefy posiadają różne ruchliwości jonów, zatem w każdej z nich wytwarza się własny gradient potencjału elektrycznego (natężenie pola elektrycznego), który ustala jednakową szybkość poruszania się stref zgodnie z zależnością: przy czym: gdzie: v – szybkość poruszania się strefy [cm/s], μ – ruchliwość jonu [cm2/V·s], E – natężenie pola elektrycznego [V/cm], ΔV – różnica potencjałów między dwiema elektrodami znajdującymi się w odległości Δl.

PODSTAWY TEORETYCZNE Ruchliwość jonów jest ściśle związana z przewodnictwem równoważnikowym elektrolitów (Λ) i z tego powodu najczęściej stosowanym (uniwersalnym) detektorem w ITP jest detektor konduktometryczny. Mierzone przewodnictwo elektrolitów opisuje równanie:

gdzie: F – stała Faradaya (96500 C/mol), α – stopień dysocjacji, μKi i μAi – ruchliwość i-tego kationu lub anionu. Z powyższego wzoru wynika, że wraz ze wzrostem ruchliwości jonów rośnie przewodnictwo elektrolitu.

PODSTAWY TEORETYCZNE Detektor konduktometryczny podczas analizy ITP mierzy przewodnictwo roztworu, zaś na izotachoforegramach mierzonym sygnałem jest opór (R) lub napięcie (U). Logicznie rozumując im wyższe przewodnictwo tym mniejszy opór/napięcie i na odwrót. Zatem wielkości te są powiązane w sposób odwrotnie proporcjonalny, co obrazują poniższe równania:

gdzie: κ – przewodnictwo właściwe [1/Ω·cm], c – stężenie molowe roztworu [mol/dm3], R – opór elektryczny [Ω] warstewki elektrolitu o przekroju S [cm2] i długości l [cm].

PODSTAWY TEORETYCZNE Z przytoczonych równań wynika, że przewodnictwo roztworu zależy od stężenia i ruchliwości jonów. Z kolei ruchliwość jonów limitowana jest: rodzajem jonu (wielkość, ładunek), rodzajem rozpuszczalnika (lepkość, solwatacja), warunkami tj.: pH, α, temp. Dla roztworów rozcieńczonych wzrost stężenia powoduje wzrost przewodnictwa. W przypadku roztworów stężonych wzajemne oddziaływanie jonów ogranicza ich ruchliwość i może powodować zmniejszenie przewodnictwa.

PODSTAWY TEORETYCZNE Podsumowując strefy układają się zgodnie z malejącą ruchliwością, czyli wraz ze spadkiem przewodnictwa, tzn. wraz ze wzrostem oporu i tym samym ze wzrostem napięcia, co wynika z prawa Ohma:

gdzie: U – napięcie elektryczne [V], R – opór elektryczny [Ω], I – natężenie prądu, stałe podczas analizy (0 – 300 μA).

EFEKT SAMOKORYGOWANIA

W danych warunkach jon nie może zmienić swojej ruchliwości – jest to cecha nadana !!!

EFEKT SAMOKORYGOWANIA Ruchliwości jonów w wodnych roztworach elektrolitów, w T = 298 K Jon

μ [cm2V-1s-1]

H+

36.3 ⋅ 10-4

Li+

4.01 ⋅ 10-4

K+

7.61 ⋅ 10-4

Ag+

6.41 ⋅ 10-4

NH4+

7.60 ⋅ 10-4

OH−

20.5 ⋅ 10-4

Cl−

8.91 ⋅ 10-4

CH3COO−

4.23 ⋅ 10-4

SO4−

8.27 ⋅ 10-4

NO3−

8.52 ⋅ 10-4

APARATURA 1.Zbiornik elektrolitu zatrzymującego (TE) 2.Blok nastrzykowy, A, B, C pozycje robocze pętli dozowniczej 3.Kolumna wstępnego rozdzielania (160 × 0,8 mm) 4.Detektor konduktometryczny 5.Blok rozgałęziający 6.Blok zatrzymujący 7.Membrana półprzepuszczalna 8.Zbiornik elektrolitu wiodącego (LE) 9.Kolumna analityczna (160 × 0,3 mm) 10.Detektor konduktometryczny 11.Detektor UV 12.Zbiornik elektrolitu wiodącego (LE) 13.Membrana półprzepuszczalna LE – zasobniki z elektrolitem wiodącym dla kolumny wstępnego rozdzielania i analitycznej.

DETEKCJA W analizie techniką ITP układ detekcyjny powinien: wykrywać możliwie jak najkrótsze strefy rozdzielanych jonów, tzn. posiadać wysoką czułość i zdolność rozdzielczą, wykrywać kolejne składniki uniwersalnej właściwości,

na

podstawie

jakiejś

rozróżniać stref, nawet gdy zachodzi tylko nieznaczna zmiana tej właściwości, wytwarzać szybką i prawidłową odpowiedź zarówno co do jakości, jak i co do ilości poszczególnych jonów.

DETEKCJA Detektory stosowane w ITP dzielimy na: Bezkontaktowe: termiczny, optyczne (np. UV) Kontaktowe: konduktometryczny, gradientu potencjału. Obecnie zaczyna wprowadzać detekcję użyciu spektrometrii (MS).

się przy mas

PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO ANALIZY Przygotowanie próbki zależy od rodzaju analizowanej matrycy:

▪ brak przygotowania próbki – analiza próbek wody pitnej niegazowanej, wina niemusującego, krwi.

▪ odgazowanie próbki poprzez jej ogrzanie – analiza próbek wody pitnej gazowanej, win musującego, piwa.

▪ usunięcie zanieczyszczeń stałych poprzez filtrację lub odwirowanie – analiza wód powierzchniowych, ścieków, soków owocowych.

▪ ekstrakcja rozpuszczalnikiem (wodą dejonizowaną lub rozcieńczonym kwasem) wspomagana ultradźwiękami po uprzedniej liofilizacji próbki – analiza próbek stałych np. owoce, warzywa, kiszonki, pasze, nawozy.

ANALIZA JAKOŚCIOWA Określenie składu jakościowego próbki polega na zidentyfikowaniu poszczególnych stref jonów w oparciu o wartości parametru RSH dla każdej ze stref i odniesieniu ich do wzorców (analiza każdego jonu z osobna). RSH (relative step height) – stosunek wysokości strefy (sygnału) dla analitu do wysokości strefy (sygnału) dla jonu terminującego.

Kolejność elucji jonów określa się na podstawie wartości parametru RSH dla roztworów wzorcowych lub w oparciu o ruchliwość jonów w danych warunkach – tabele fizykochem.

ANALIZA ILOŚCIOWA Określenie zawartości oznaczanych jonów w próbce polega na odczytaniu długości (L) zidentyfikowanych stref i przeliczeniu ich na stężenie w oparciu o równania wcześniej sporządzonych krzywych wzorcowych (L = f(c)).

ANALIZA ILOŚCIOWA

ZALETY ITP możliwość jednoczesnego oznaczania wielu jonów (o tym samym znaku), jednoczesne oznaczanie jonów na różnych poziomach stężeń, możliwość oznaczenia składników śladowych w złożonych matrycach dzięki zastosowaniu dwóch kolumn, proste i szybkie przygotowanie próbek (z reguły wystarcza sączenie, odwirowanie lub prosta ekstrakcja wodą), a nawet możliwość bezpośredniej analizy bez wstępnego przygotowania próbki, co z kolei ogranicza straty analitów i skraca całkowity czas analizy, krótki czas analizy (od kilku do kilkunastu minut),

ZALETY ITP stosunkowy niski koszt aparatury (strzykawki, ogólnie dostępny sprzęt laboratoryjny – kolby, zlewki, pipety), możliwość stosowanie (konduktometrycznego),

uniwersalnego

detektora

wysoka powtarzalność i dokładność wyników analizy, stosunkowo niska granica wykrywalności i oznaczalności – standardowo poniżej ppm, a przy zastosowaniu wzbogacania próbek (np. SPE) rzędu ppb, zatężenie próbek podczas procesu rozdzielania, technika przyjazna środowisku – głównie próbki wodne, możliwość zastosowania w analizach on-line.

WADY ITP trudności przy doborze składu elektrolitów (szczególnie e. wiodącego; stabilizatory pH, dodatki antykonwekcyjne, przeciwelektroosmotyczne), brak możliwości stosowania rozpuszczalników organicznych – ograniczenie dla próbek tłuszczów itp., w przypadku oznaczania wybranych związków organicznych (np. aldehydów) konieczna jest derywatyzacja, konieczność stosowania roztworów wzorcowych, możliwość oznaczania wyłącznie substancji jonowych.

ZASTOSOWANIA I. Przemysł spożywczy – oznaczanie kationów w próbkach wody pitnej, sokach owocowych, warzywach, owocach.

ZASTOSOWANIA I. Przemysł spożywczy – oznaczanie kwasu sorbowego i innych kwasów organicznych w próbkach żywności, tj. napoje, wina, dżemy, produkty mleczne, soki.

ZASTOSOWANIA I. Przemysł spożywczy – oznaczanie azotanów i azotynów w próbkach warzyw i owoców.

ZASTOSOWANIA I. Przemysł spożywczy – oznaczanie glutaminianów (dodatek smakowy) w żywności głównie zupach i sosach.

ZASTOSOWANIA I. Przemysł spożywczy – oznaczanie kwasu cytrynowego i izo-cytrynowego w sokach (wykrywanie zafałszowań).

ZASTOSOWANIA II. Medycyna – oznaczanie zawartości kwasu ditiooctowego (metabolit kancerogennego chlorku winylu) w próbkach moczu.

ZASTOSOWANIA II. Medycyna – oznaczanie zawartości kwasu sialowego w surowicy krwi (informacja o chorobie raka lub możliwych przerzutach).

ZASTOSOWANIA III. Analiza próbek środowiskowych – oznaczanie zawartości wybranych makro- i mikroelementów (w postaci anionów) w próbkach wód powierzchniowych, ścieków, a także wód pitnych.

ZASTOSOWANIA III. Analiza próbek środowiskowych – oznaczanie zawartości metali ciężkich w próbkach wód powierzchniowych, ścieków, a także wód pitnych.

ZASTOSOWANIA IV. Rolnictwo – oznaczanie zawartości lizyny (aminokwasu niesyntezowanego przez organizmy żywe) w karmach i paszach.

ZASTOSOWANIA IV. Rolnictwo – oznaczanie zawartości kwasów organicznych w paszach kiszonych (tzw. kiszonkach); kontrola procesu fermentacji i ocena jakości produktu.

ZASTOSOWANIA Analiza organiczna: Oznaczanie kwasów tłuszczowych i ich pochodnych, Oznaczanie kwasów aromatycznych, Oznaczanie fenoli i ich pochodnych, Oznaczanie nitrofenoli, Oznaczanie aldehydów, Oznaczanie amionokwasów, Oznaczanie kationów organicznych np. kation triazynowy, Oznaczanie herbicydów anionowych i kationowych. Analiza nieorganiczna: Oznaczanie anionów: Cl-, NO2-, NO3-, SO42-, F-, PO43-, P2O74-, Oznaczanie kationów: Fe3+, Al3+, K+, Na+, Li+, Ba2+, Sr2+, Rb+, Cs+, Mn2+, Cd2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Pb2+, Cu2+, Ca2+, Mg2+.

DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ